熒光定量技術(shù)原理
點擊次數(shù)：2934 更新時間：2019-01-28
熒光定量技術(shù)原理
聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數(shù)級的擴增。在擴增反應(yīng)結(jié)束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經(jīng)PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運而生。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測從而實現(xiàn)對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。
一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值。
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